Uso de nanoporos para detectar cambios epigenéticos más rápido

Los cambios conocidos como alteraciones epigenéticas juegan un papel importante en el desarrollo del cáncer. La capacidad de analizarlos de manera rápida y confiable puede contribuir en gran medida al desarrollo posterior de la terapia personalizada. Un equipo de investigación del Instituto de Fisiología de la Universidad de Freiburg ha logrado caracterizar los cambios químicos en las proteínas que son típicos de las modificaciones epigenéticas mediante el análisis de nanoporos. Los investigadores publicaron sus hallazgos en Revista de la Sociedad Química Estadounidense (Jack).

En los últimos años, los nanoporos se han convertido en una herramienta ampliamente aplicable para el análisis de moléculas. Debido a sus propiedades especiales, permiten analizar la estructura de las moléculas en milisegundos: como proteínas dispuestas cilíndricamente, los nanoporos forman pequeños canales de unas pocas millonésimas de milímetro (nm) de diámetro que pueden incrustarse en biopelículas.

«Para los experimentos, aplicamos un voltaje constante a través de la membrana para que los iones del medio circundante fluyan a través de los poros. Esto crea una corriente eléctrica constante que se puede medir con precisión», explica el Prof. Dr. Jan C. Bernds de la Facultad. de Medicina. En la Universidad de Friburgo, donde se realizaron en su laboratorio los experimentos ahora publicados. Sin embargo, cuando la molécula se mueve hacia los poros, la corriente se bloquea: cuanto más grande es la molécula, mayor es también la fuerza de su bloqueo.

Proteína en el punto de mira de la investigación: H4

En el curso de los experimentos ahora publicados, los científicos de Friburgo se han dedicado a estudiar la llamada proteína histona H4. Esta proteína se une estrechamente al ADN en todas las células que tienen un nucléolo y es uno de los objetivos mejor investigados para las modificaciones epigenéticas. La región en el extremo N de la proteína se ve afectada específicamente por estas modificaciones.

«Los secuencia de proteína Allí contiene el aminoácido lisina muchas veces», explica Bernds. Acetilo o grupos metiloEstas lisinas, por ejemplo, que se denominan K8, K12 y K16 según su posición en la cadena proteica, pueden unirse como parte de modificaciones epigenéticas. Cualquier modificación química que ocurra en cualquier posición de la lisina es sin duda de importancia médica, señala el fisiólogo de Freiburg. «La acetilación en K16, por ejemplo, es importante para el desarrollo humano, mientras que la metilación en K12 desempeña un papel en el desarrollo de algunos tumores de próstata y pulmón, según los últimos hallazgos del Centro Médico de la Universidad de Freiburg».

Detección de cambios con la ayuda de nanopore

En sus experimentos, Bernds y su equipo ahora pudieron distinguir claramente los fragmentos H4 con y sin acetilación, así como los fragmentos que contenían una, dos o tres acetilaciones. Además, lograron demostrar que los nanoporos que utilizaron también eran sensibles al sitio de acetilación: fragmentos de histonas con grupo acetilo En K8, la corriente a través de los poros fue inhibida más fuertemente que la de acetilación en K12, y estos, a su vez, fueron más fuertes que los de K16 acetilado.

«Este tipo de sensibilidad es sorprendente porque estas partes son idénticas en términos de masa y tamaño total», dice Bernds. Por lo tanto, la corriente de poros parece ser sensible no solo al tamaño de la molécula, sino también a su forma. También fue fácil distinguir entre las diferentes variantes de los fragmentos de histonas diacetilados – K8, K12, K8, K16, K12 y K16 – nuevamente, a pesar de la masa idéntica. Los fragmentos H4 se metilaron en diferentes rangos y en diferentes sitios también bloquearon la corriente a través de los poros en diferentes grados, aunque no tan pronunciados como las variantes acetiladas.

«Hemos podido mostrar por primera vez a través de nuestros experimentos que los análisis de nanoporos nos permiten distinguir moléculas no solo por su tamaño, sino también por su forma», dice el líder del estudio, Bernds. Las simulaciones de dinámica molecular realizadas por el grupo de investigación dirigido por Alexei Aksmentev de la Universidad de Illinois en los EE. UU., también involucrado en el estudio, muestran que un campo eléctrico altamente heterogéneo dentro de los poros juega un papel importante en este efecto.

Visión de futuro: diagnóstico médico óptimo

Mientras que la secuenciación de ADN usando nanoporos ya se ha establecido y comercializado, el desarrollo del análisis proteómico basado en nanoporos apenas está comenzando, dice Bernds. «La dificultad de secuenciar proteínas es que son moléculas con patrones de carga muy irregulares». Mientras que el ADN, que tiene carga negativa, migra direccionalmente en el campo eléctrico y, por lo tanto, puede ser arrastrado a través de la base del poro por base, las proteínas están formadas por bloques de construcción hechos de aminoácidos con diferentes cargas. Como resultado, el movimiento dirigido en el campo eléctrico y la «exploración» de aminoácidos por aminoácidos no es posible. Entonces, los científicos de Friburgo adoptaron un enfoque diferente para sus experimentos. En lugar de poros de constricción corta, como los que se usan para la secuenciación del ADN, usaron poros especialmente diseñados con un tipo de trampa molecular. «Esto permitió capturar todo el fragmento de proteína a la vez», dice Bernds.

Todavía no está claro qué tamaño de porción se puede usar para este tipo de análisis. Sin embargo, experimentos adicionales muestran que el método también será adecuado para el análisis de fragmentos H4 utilizados anteriormente en la investigación epigenética. Estos ácidos contienen 14 aminoácidos en lugar de los 10 utilizados aquí, y actualmente se están investigando. Modificaciones epigenéticas Con espectrometría de masas en tándem, que es una tecnología muy compleja. Los investigadores esperan que los nanoporos hagan que el análisis sea más simple, rápido y rentable, y que se pueda realizar cerca del paciente.

El mayor desarrollo del nanoanálisis de proteínas para el diagnóstico médico y su implementación en productos y servicios concretos es también uno de los proyectos centrales del recientemente aprobado BMBF Cluster4Future nanodiagBW, que Behrends dirige junto con el Prof. Dr. Felix von Stetten de Hahn-Schickard. -Gesellschaft, que lideran este proyecto.