«Buscamos desarrollar un enfoque de edición del genoma que permita la fijación fácil y precisa de casi cualquier alteración genética en un cromosoma y al mismo tiempo supere los desafíos de otras técnicas.«Benjamín Kleinstefer
Las tecnologías de edición del genoma han revolucionado la biología molecular, permitiendo modificaciones precisas del código genético. Los enfoques tradicionales, como CRISPR-Cas9, se han adoptado ampliamente por su capacidad para introducir cambios específicos con relativa facilidad. Sin embargo, estas técnicas a menudo tienen limitaciones, incluidos efectos fuera del objetivo y la necesidad de rotura de doble cadena (DSB), que puede provocar mutaciones no deseadas, cambios cromosómicos y detención del ciclo celular.
Los desarrollos recientes han buscado abordar estos desafíos, con el objetivo de lograr una mayor precisión y reducir los daños colaterales. Entre estas innovaciones, la edición básica y la edición sin formato han demostrado ser exitosas, pero aún conllevan limitaciones en el alcance de la edición posible, la eficiencia y la facilidad de uso, por ejemplo.
“Buscamos desarrollar un enfoque de edición del genoma que permita la fijación fácil y precisa de casi cualquier cambio genético en un cromosoma y al mismo tiempo supere los desafíos de otras tecnologías.
Para ello, su equipo (incluidos los primeros coautores del artículo, Joanna Ferreira da Silva y Connor J. Tu) desarrolló un sofisticado sistema de enzimas conjugadas. El editor de clic (CE) es una proteína de fusión que comprende una ADN nickasa programable por ARN, una ADN polimerasa dependiente de ADN (DDP) y un dominio de unión a ADN monocatenario (ADNss) derivado de endonucleasas HUH (consulte la Figura 1).
Esta combinación permite que CE se dirija a loci genómicos dirigidos por ARN específicos. El dominio de endonucleasa HUH une covalentemente el «ADN de clic» (clkDNA), que codifica las modificaciones requeridas, al ADN genómico en el sitio de corte. Luego, la ADN polimerasa utiliza estas plantillas para incorporar con precisión los cambios genéticos.
«Nuestro estudio describe el desarrollo de un editor de clics de primera generación, que utiliza enzimas de tipo salvaje y plantillas de ADN mínimamente modificadas o sin modificar llamadas clkDNA», explica Benjamin Kleinstiver.
De manera similar a la edición principal, la edición con clic mostró menos efectos fuera del objetivo que los métodos convencionales de endonucleasa CRISPR-Cas9. El nuevo método logró modificaciones genómicas precisas, como sustituciones, inserciones y eliminaciones, con una eficacia de hasta el 30 % en varios tipos de células humanas, incluidos los fibroblastos primarios. En algunos casos, la técnica de edición con clic logró una mayor eficiencia que PE1 (versión 1 de preedición), pero en general la eficiencia fue menor que PE2 (versión 2 de preedición) y PE3 (versión 3 de preedición), que utilizan transcriptasa inversa. dominios diseñados para mejorar el rendimiento (ver Figura 2).
Cabe destacar que el diseño modular de la edición con clic permite una detección rápida y de alto rendimiento de plantillas de clkDNA con diferentes modificaciones, lo que brinda flexibilidad para optimizar las condiciones de edición. Esta escalabilidad es una ventaja para ajustar el método para lograr mayores eficiencias y necesidades de edición específicas.
“Somos optimistas sobre los futuros enfoques de ingeniería para mejorar tanto la proteína del editor de clics como las plantillas clkDNA, y prevemos que esto mejorará la eficiencia y eficacia de la edición de clics. Además, estamos entusiasmados con los conceptos ampliados de edición de clics que pueden incluir tipos de edición adicionales. y longitudes, incluidas aquellas “para la instalación de secuencias precisas y seguras del tamaño de un exón o gen”, afirma Benjamin Kleinstiver.
El estudio fue dirigido por investigadores del Hospital General de Massachusetts y la Facultad de Medicina de Harvard, incluidos Joanna Ferreira da Silva, Connor Tu y Benjamin Kleinstefer. Y los resultados fueron Publicado hoy en Nature BiotechnologyEl año pasado se publicó una versión preliminar del estudio en servidor bioRxiv.
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