El estudio encontró que ACE-2 no se requiere bioquímicamente para la fusión de membranas SARS-CoV2.

Se publicó un estudio en bioRxiv* El servidor de preimpresión probó la hipótesis de que el receptor 2 de la enzima convertidora de angiotensina (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (ACE-2) no solo es un factor de unión en la infección viral, sino que también juega un papel en la activación de la proteína de pico viral Para facilitar la fusión de membranas.

antecedentes

El SARS-CoV-2 infecta las células humanas con la ayuda del receptor ACE-2 del huésped. La proteína de pico viral controla la entrada y la infección del virus SARS-CoV-2 porque se une al receptor ACE-2 en la superficie de la célula humana. ACE-2 se activa por escisión proteolítica e impulsa la fusión entre la membrana celular y la envoltura viral.

La evidencia circunstancial de los estudios sugiere que ACE-2 no solo puede actuar como un factor de unión, sino que también puede ayudar a activar la proteína de fusión de membrana SARS-CoV-2. Una mejor comprensión del papel de ACE-2 en la fusión de membranas podría ayudar a dilucidar el mecanismo subyacente a la infección por SARS-CoV-2 y predecir la evolución futura del SARS-CoV-2 y otros virus similares.

el estudio

En este estudio, los investigadores utilizaron hebras de ácido desoxirribonucleico (ADN) porque pueden ingresar a las membranas de manera irreversible y permitir el autoensamblaje programable.

Usando este enfoque, se pueden insertar cadenas de ADN complementarias acopladas a lípidos en partículas virales para que los liposomas sintéticos puedan dirigirse a las partículas sin la necesidad de receptores fisiológicos. Luego, los catalizadores necesarios para la fusión se reformulan y prueban químicamente. La fusión se detecta con la ayuda de microscopía óptica de un solo virus, en la que los cambios en el estado viral durante la fusión se controlan con tintes fluorescentes. Anteriormente, los investigadores utilizaron un enfoque de unión de lípidos al ADN para caracterizar la entrada viral de diferentes familias de virus, incluidos los flavivirus y los mixovirus.

Los investigadores midieron la unión y la fusión dependientes de picos en membranas sintéticas y celulares, con la ayuda de liposomas sintéticos, para garantizar la ausencia del receptor ACE-2. Tres mutantes de SARS-CoV-2, D614G/N501Y, Wuhan y Omicron (B.1.1.529), y dos partículas virales, partículas similares a virus (VLP), se producen mediante la expresión de proteínas S, M, E y N y pseudovirus. en el núcleo del VIH – se utilizaron en experimentos.

El equipo incubó las membranas objetivo y las partículas virales por separado con cadenas de ADN complementarias unidas a los lípidos DPPE. Instalaron membranas objetivo en una celda de flujo de microfluidos, lo que permitió que las partículas virales se adhirieran.

consecuencias

Los eventos de fusión solo se encuentran cuando las partículas virales se unen a las membranas objetivo y cuando hay proteasas presentes. La fusión se controló principalmente mediante la mezcla de lípidos entre la membrana diana y la partícula viral y se detectó mediante el colorante Texas Red en la envoltura viral, lo que resultó en una fluorescencia mejorada. La unión al ADN mediada por virus-ACE-2 fue específica; El número de partículas adsorbidas disminuyó más de 25 veces cuando se eliminó el ADN. De manera similar, no hubo eventos de fusión en ausencia de proteasas exógenas.

Al comparar la cinética de fusión viral de los picos seudotipados de Omicron y Wuhan en los núcleos de VIH Wuhan D614G/N501Y utilizados en este estudio, el equipo descubrió que, si bien ambos pseudovirus mostraron tasas de fusión similares, las VLP dieron como resultado tasas de fusión leves pero significativamente más rápidas.

La diferencia observada en las tasas de fusión podría deberse a una variedad de factores, incluidas las diferencias en la densidad proteica elevada en las VLP en comparación con el núcleo del VIH, las proteínas E y M en las VLP, las mutaciones D614G/N501Y y la proporción de pico activo en la superficie de la VLP. .

Cuando se varió la proteasa utilizada para la activación en los experimentos de Omicron y Wuhan, las tasas de fusión no fueron sensibles a las concentraciones de proteasa en el rango de 200 a 1000 μg/mL. De acuerdo con informes anteriores, la proteasa transmembrana, serina 2 (TMPRSS2) no fue eficaz en la activación de picos de omicrones de fusión de membrana. Sin embargo, en el caso de las partículas D614G/N501Y, la adición de 40 μg/ml de TMPRSS2 dio como resultado diferentes cinéticas de fusión de 200 μg/ml de tripsina.

Estas observaciones sugieren que la escisión proteolítica puede no ser el paso limitante de la velocidad de fusión de la membrana para las VLP unidas al ADN, ya que cambiar la concentración de proteasas debería afectar la formación del complejo de sustrato enzimático y los cambios en la identidad de la proteasa deberían alterar la cinética de fusión.

Tras la adición simultánea de ACE-2 soluble a la proteasa, se observó un aumento significativo en la velocidad de la cinética de mezcla de lípidos en experimentos con tornillos de Wuhan y Omicron. Esto demuestra que aunque la conformación de la proteína espiga requerida para la fusión de la membrana puede alcanzarse sin ACE-2, los receptores ACE-2 promueven conformaciones elevadas que favorecen la fusión de la membrana.

conclusión

En general, los autores señalan que tras la activación con la proteasa adecuada, los pseudovirus SARS-CoV-2, así como las VLP, no requieren ACE-2 para la incorporación a la membrana. Sin embargo, la adición de ACE-2 soluble aceleró la reacción de fusión en la cepa Wuhan SARS-CoV-2 y la variante Omicron. Los resultados del análisis cinético revelaron al menos dos pasos para determinar la tasa de fusión de la membrana viral. Uno de los pasos se basó en ACE-2, mientras que el otro no.

Los resultados anteriores confirman que el receptor ACE-2 no es bioquímicamente necesario para la fusión de la membrana del SARS-CoV-2 en el caso de un factor de unión alternativo. Dado que ACE-2 actúa como un factor de alta afinidad para la unión viral a las células humanas, su reemplazo por otros factores de unión puede afectar la capacidad del SARS-CoV-2 para evolucionar y el entorno de aptitud viral de los futuros coronavirus emergentes.

*Nota IMPORTANTE

bioRxiv publica informes científicos preliminares que no están sujetos a revisión por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica/comportamiento relacionado con la salud ni tratarse como información establecida.