Método para eliminar mutaciones en el sitio de escisión de furina del SARS-CoV-2 en células Calu-3.

Para combatir la epidemia mundial del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), se han desarrollado procedimientos de vacunación y tratamiento a un ritmo rápido. Sin embargo, el SARS-CoV-2 continúa mutando y adaptándose a los humanos, lo que requiere una revisión de la efectividad de las contramedidas médicas actuales o el desarrollo de nuevas medidas a corto y largo plazo. Destacó los esfuerzos para averiguar si las vacunas contra el SARS-CoV-2 de primera generación son eficaces contra la forma delta altamente contagiosa.

Todas las primeras cepas de SARS-CoV-2 se cultivaron en líneas celulares de mono verde africano Vero. Las células Vero se multiplican rápidamente y expresan altos niveles de enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), una molécula reconocida por el RBD (dominio de unión al receptor) de la proteína de pico que el SARS-CoV-2 usa para ingresar a las células epiteliales en el pulmón. La preactivación de la proteína de pico mediada por furina mejora la entrada viral a través del receptor ACE2. Por otro lado, el SARS-CoV-2 puede ingresar a las células Vero a través de endocitosis, lo que hace innecesario el uso de receptores ACE2.

Varios estudios han encontrado que la propagación de SARS-CoV-2 en líneas celulares derivadas de Vero conduce a una rápida acumulación y pérdida del sitio de escisión funcional de la furina en unos pocos pases. Como consecuencia, la propagación del SARS-CoV-2 en las células Vero produjo cepas de desafío con defectos en el sitio de escisión de la furina, lo que las hacía no patógenas en los animales.

Los autores de un nuevo estudio publicado en la revista Virus, estudió cómo la propagación del SARS-CoV-2 asociado con B.1.351 (una variante beta) en dos tipos de células, células Vero / hSLAM y Calu-3, que afectaron la secuencia del genoma viral dentro y fuera de la división del gen de la espiga de furina sitio. Cuando el virus se cultivó en células Vero / hSLAM, los autores observaron una expansión de las mutaciones en el sitio de escisión de la furina, pero se eliminaron cuando se cultivaron en células Calu-3. Además, se detectaron distintas variantes que se acumularon cuando este stock de virus se cultivó en células Calu-3. En particular, las reservas de virus derivados de Calu-3 siguieron siendo patógenas en los hámsteres, al igual que las variantes específicas de Calu-3. Estos resultados apoyan el crecimiento de reservas de desafío de SARS-CoV-2 en células Calu-3 antes de su uso en animales con el fin de mantener intacto el sitio de escisión del virión y la enfermedad viral.

estudiando

Se necesitan condiciones apropiadas de propagación del virus para mantener intacto el sitio de escisión de la furina en las poblaciones de virus del SARS-CoV-2. Los autores querían saber si la replicación de la cepa B.1.351 de SARS-CoV-2 en células Calu-3 daría como resultado una reserva viral libre de mutaciones y la eliminación del sitio de escisión de la furina, incluso si la reserva ya se había pasado dos veces. en células Vero. Los autores querían saber si la propagación del virus en las células Calu-3 eliminaría las subpoblaciones de virus que se acumulan con la secuencia de sitios de grietas de furina mutantes y evitaría la generación de virus utilizando variantes novedosas o la eliminación de este sitio debido a adaptaciones de cultivos celulares.

El mismo aislado p3 de la cepa de virus B.1.351 que se pasó dos veces a través de células Vero E6 fue obtenido por dos laboratorios diferentes (BEI Resources y BIOQUAL). Las mutaciones acumuladas previamente en el sitio de escisión de la furina se perdieron de la población cuando se cultivaron independientemente en células Calu-3 en cada sitio.

Por otro lado, BEI Resources crió el mismo stock en células Vero-hSLAM y descubrió que los mutantes del sitio de escisión de Furin sobrevivían en la población. Estos resultados son consistentes con investigaciones recientes que utilizaron células Calu-3 para hacer crecer SARS-CoV-2 desde el principio para aislar y producir variantes pseudovirales. Los virus del SARS-CoV-2 con un sitio de división de furina intacto infectan las células Calu-3 más rápidamente en cada una de estas investigaciones.

Los autores ampliaron este hallazgo al descubrir que cuando las variantes B.1.351 ‘beta’ de SARS-CoV-2 con mutaciones puntuales del sitio de escisión de furina se propagaron en células Calu-3, también se perdieron de la población. Este resultado indica que cuando se cultivan en células Vero, todos los SARS-CoV-2 de interés recolectarían modificaciones del sitio de escisión de la furina, pero podrían eliminarse si se produjeran en Calu-3 antes de su uso en animales.

Los investigadores infectaron a cuatro hámsteres con la cepa BQ-RSA-p4 derivada de Calu-3 para ver si las mutaciones específicas de Calu-3 sobrevivían in vivo. En estos animales, el virus creció bien, con títulos virales subgenómicos superiores a 107 copias / g de tejido pulmonar, similar a los resultados mostrados en hámsteres infectados con el aislado WA / 2020 (Wuhan). El hámster perdió aproximadamente el 15% de su peso corporal, lo que indica que las mutaciones asociadas con Calu-3 tuvieron poco efecto sobre la patogenicidad del virus en los hámsteres.

En comparación, los hámsteres infectados con cepas a las que les faltaba un sitio de escisión de furano perdieron una cantidad mínima de peso. Las variaciones en las poblaciones de hámsters derivadas de Calu-3 se mantuvieron o ampliaron. La investigación futura necesitará saber si otras variantes de la cepa del SARS-CoV-2 (por ejemplo, B.1.617.2) adquieren las mismas variantes de nucleótidos cuando se cultivan en células Calu-3 o si las variantes de nucleótidos descritas aquí solo están presentes en B. proporciones 1.351 .

Ramificaciones

Estos resultados confirman un proceso que requiere la secuenciación completa de una vacuna desafiante para obtener una imagen completa de la complejidad de las poblaciones de virus. Las frecuencias variables continuarán cambiando a medida que las reservas de desafío SARS-CoV-2 se adapten a los entornos de cultivo celular, ya que se implementan regularmente en múltiples ubicaciones. Es necesario averiguar si la variante viral patógena en el animal surgió de cero o ya estaba presente en la vacuna. Como resultado, estudiar la diversidad de virus fuera de la secuencia de consenso es fundamental para identificar cambios fundamentales que pueden alterar la patogenicidad del virus. A partir de estos resultados, se puede sugerir que cada estudio de desafío in vivo debería incluir una caracterización de la complejidad del stock de desafío.