¿Por qué utilizamos la dispersión de luz para analizar proteínas y vectores virales?

En esta entrevista, la Dra. Michelle Chen, directora senior de ciencias analíticas de Wyatt Technology, habla con NewsMedical sobre cómo se pueden utilizar técnicas de dispersión de luz para analizar proteínas para la cuantificación de atributos múltiples (MAQ).

¿Cuáles son las diferentes técnicas de dispersión de luz utilizadas para caracterizar macromoléculas y nanopartículas?

Hay tres técnicas de dispersión de luz que se utilizan para caracterizar macromoléculas y nanopartículas: estática, dinámica y electroforesis.

Dispersión de luz estática Mide la intensidad promediada en el tiempo en múltiples ángulos de dispersión. Este método, a menudo llamado dispersión de luz multiángulo (MALS), proporciona mediciones absolutas del peso molecular de proteínas y otras biomoléculas en solución, independientemente de su forma. El peso molecular se determina a partir de la densidad de dispersión total combinada con la concentración molecular, que generalmente se mide mediante UV o refractometría diferencial (dRI).

MALS también puede medir el tamaño y la concentración de nanopartículas. Aquí, la dependencia angular de la luz dispersada da lugar al tamaño de partícula en función del radio cuadrático medio, R_gramo. Para partículas esféricas, esto se puede convertir al radio de la esfera, y conociendo el radio combinado con la densidad total dispersada se obtiene la concentración de partículas (partículas/mL).

Crédito de la imagen: ShutterStock/Katrina Kuhn

MALS se utiliza para caracterizar terapias biológicas como proteínas, virus adenoasociados (AAV) y nanopartículas lipídicas (LNP). El instrumento DAWN MALS generalmente se combina con cromatografía analítica de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico o fraccionamiento de flujo de campo para la separación inicial antes de la detección, lo que proporciona un análisis detallado. Por otro lado, el instrumento UltraDAWN MALS es la versión de tecnología analítica de procesos (PAT) de DAWN, utilizada para desarrollar, monitorear y controlar procesos críticos posteriores en diferentes niveles.

Deconvolución de luz dinámica (DLS) mide las fluctuaciones de intensidad en la luz dispersa resultantes del movimiento browniano de moléculas o moléculas luminosas. Al analizar la dependencia temporal de las fluctuaciones, se puede obtener el coeficiente de difusión traslacional, que se utiliza para calcular el radio hidrodinámico o R_h. La combinación de DLS y SLS permite estimar la concentración de partículas, incluso para una muestra heterogénea con múltiples tamaños de población.

Un instrumento DLS común es el lector de placas DynaPro, que normalmente se utiliza para escanear de decenas a cientos de muestras que representan diferentes condiciones de formulación o partes del proceso. Para tareas más sencillas, DynaPro NanoStar mide el tamaño y la concentración de las partículas en microvasos utilizando tan solo 2 μl de solución.

Dispersión de luz eléctrica (ELS) es la tercera técnica de dispersión de luz, también conocida como dispersión de luz por análisis de fase (PALS). Mide el cambio de frecuencia del rayo láser incidente resultante del movimiento de muestras cargadas en un campo eléctrico, a partir del cual se puede calcular el potencial de carga, o zeta.

¿En qué se diferencia la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) del fraccionamiento de flujo de campo (FFF)?

Los detectores MALS y DLS se utilizan a menudo en combinación con cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) o fraccionamiento de flujo de campo (FFF), también conocido como fraccionamiento de flujo de campo asimétrico (AF4). SEC y FFF proporcionan separación basada en el tamaño hidrodinámico de la muestra, mientras que la adición de detectores posteriores proporciona una caracterización en profundidad de las propiedades biofísicas de la muestra.

Crédito de la imagen: ShutterStock/LuckyStep

segundo Se utiliza una fase estacionaria que consta de perlas o resinas porosas con tamaños de poro definidos. Las moléculas más pequeñas difunden dentro y fuera de los poros, lo que resulta en un tiempo de residencia más largo, mientras que las moléculas más grandes entran en menos poros y, por lo tanto, se eliminan antes que las moléculas más pequeñas.

FFF Separa partículas o moléculas en un canal abierto, sin fase estacionaria. Durante el modo de enjuague, existen dos tipos de flujos: flujo de canal horizontal y flujo ortogonal. Las partículas pequeñas se difunden contra el flujo cruzado con mayor eficacia que las partículas más grandes y se alejan del fondo del canal. Debido al perfil de flujo del canal parabólico, las moléculas más pequeñas son transportadas por una velocidad de flujo más alta en relación con las moléculas más grandes, por lo que el orden de elución se invierte en FFF en comparación con SEC, donde las moléculas pequeñas eluyen primero.

Debido a que no hay una fase estacionaria dentro del canal FFF, la separación FFF suele ser más adecuada que la SEC para muestras con dimensiones superiores a 30 nm, muestras que se adhieren a columnas y/o aquellas que son sensibles al corte.

¿Cuáles son los principales beneficios de SEC-MALS para el análisis de AAV y cómo se compara con otros métodos analíticos? ¿Cómo recomendaría configurar un sistema y desarrollar métodos SEC-MALS adecuados para el análisis de AAV?

La separación SEC puede resolver agregados y fragmentos, pero no puede separar AAV vacíos y completos. Los virus vacíos y completos eluirán en el mismo pico, ya que los AAV tienen el mismo radio hidrodinámico. Sin embargo, con datos de MALS en línea y detectores de concentración, se pueden calcular las concentraciones en blanco y completas del pico del monómero de AAV y otros picos de interés.

En un solo dispositivo, SEC-MALS mide el peso molecular y la concentración de las cápsides de AAV y el ADN de la envoltura (similar a lo que se obtiene de una combinación de ELISA y ddPCR) con solo una alícuota de 10 a 100 μl de AAV, en un corto tiempo de ejecución. 30 minutos y sin reactivos, lo que permite ahorrar tiempo y materiales al mismo tiempo que aumenta la exactitud y la precisión.

El módulo de análisis de vectores virales del software ASTRA, proporcionado por Wyatt Technology, calcula varios CQA específicos de AAV: concentración total del genoma de AAV Vg, concentración de la cápside de AAV Cp y Vg/Cp, la relación entre la cápside completa y total. ASTRA también calcula la concentración de AAV en blanco, simplemente Cp menos Vg, y el contenido total.

Crédito de la imagen: ShutterStock/BillionImages

Se recomiendan los siguientes detectores para un sistema AAV optimizado para la cuantificación de atributos múltiples (MAQ): instrumento DAWN MALS, detector Optilab dRI y detector UV de múltiples longitudes de onda. Es importante tener parámetros precisos de extinción de UV y cápside específicos del serotipo. La técnica de White proporciona coeficientes de extinción predeterminados que son razonablemente precisos para todos los serotipos de AAV, pero se pueden determinar valores más precisos utilizando otro método ASTRA que utiliza instrumentación Optilab y detectores UV.

Luego, los valores del coeficiente de extinción se utilizan con los sistemas MALS-UV-dRI o MALS-UV260-UV280 para determinar títulos en blanco y completos precisos junto con Vg/Cp, y para determinar las especies totales y las cantidades totales. Además de los principales CQA mencionados anteriormente (contenido de la cápside, título de la cápside, título del genoma y ensamblaje), se puede utilizar la misma serie SEC-MALS para caracterizar el peso molecular de la proteína y el ADN, la integridad de la cápside, el tamaño de la cápside y el ADN libre.

El contenido del montaje es un criterio de calidad importante. Cabe señalar que, dado que SEC puede filtrar o desactivar agregados grandes, FFF-MALS puede ser más adecuado para analizar el AAV total.

El estado SEC definido en nuestro manual de instrucciones SOP proporciona una buena separación de monómeros, agregados y fragmentos para diferentes serotipos de AAV. El método AAV SEC-MALS de Wyatt se ha adoptado como método principal para bastantes programas AAV. Se utiliza para múltiples serotipos y en diferentes etapas de desarrollo y producción comercial.

¿Qué desafíos surgen al caracterizar las LNP en comparación con las proteínas y los AAV?

En comparación con las proteínas y los AAV, los LNP son relativamente de menor calidad en esta etapa debido a su novedad y la disponibilidad limitada de herramientas de caracterización específicas del método. La complejidad de las LNP surge de su gran tamaño y heterogeneidad. Mientras que las muestras de proteínas o AAV suelen mostrar menos especies distintas, las muestras de LNP suelen mostrar una distribución continua en tamaño, peso molecular y carga útil.

Varias características físicas de las LNP, que se enumeran a continuación, son esenciales para su caracterización y cuantificación. Utilizando métodos tradicionales, se necesitan unas 10 pruebas diferentes para cubrir esta lista.

DLS se utiliza a menudo para analizar el tamaño y la polidispersidad de LNP para respaldar la formulación, el desarrollo y la optimización de procesos. Sin embargo, DLS adolece de baja resolución en comparación con otros métodos de dispersión de luz como SEC-MALS. Incluso una pequeña cantidad de agregados grandes puede provocar un gran cambio en el tamaño promedio. Como resultado, los resultados de DLS a veces son sólo cualitativos.

El ensayo fluorescente RiboGreen se ha utilizado ampliamente para medir la carga de ARN y la eficiencia de encapsidación. Sin embargo, esta prueba de concentración indirecta puede introducir grandes errores experimentales y variaciones de usuario a usuario. Además, no revela variación en la carga de ARN ni en las dosis de tamaño de LNP.

Crédito de la imagen: ShutterStock/Katrina Kuhn

Acerca de la Dra. Michelle Chen​​​​​​

La Dra. Michelle Chen es la directora de ciencias analíticas de Wyatt Technology.^MTPortafolio de empresas de agua^MT. Obtuve un doctorado. Recibió su doctorado en el Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Yale, donde se centró en el desarrollo de nuevos métodos de HPLC para la separación rápida y altamente eficiente de biopolímeros.

Desde que se unió a Wyatt Technology, el Dr. Chen ha combinado la dispersión de luz multiángulo, la detección de dispersión de luz dinámica mediante HPLC y el fraccionamiento de flujo de campo para caracterizar polímeros, proteínas y nanopartículas sintéticas y biológicas.

En los últimos años, ha dirigido el equipo de aplicaciones de White para desarrollar nuevos métodos para caracterizar y cuantificar nanobiopartículas emergentes, incluidos vectores virales, nanopartículas lipídicas y vesículas extracelulares.

Acerca de la tecnología blanca

White Technology, una división de Waters Corporation, Desarrollar hardware, software y técnicas para la caracterización de macromoléculas y nanopartículas, en soluciones, basadas en dispersión de luz y técnicas afines. Las propiedades físicas determinadas por los productos de White incluyen la masa molar absoluta de proteínas, polímeros y otras macromoléculas. Volumen y carga (potencial zeta); Proteína-proteína y otras interacciones biomoleculares. Formación de proteínas conjugadas y copolímeros. Y conformación molecular.

Productos y servicios

La línea de productos de Wyatt incluye herramientas y software para:

• Dispersión de luz multiángulo en línea (MALS), utilizada junto con cromatografía de exclusión por tamaño para determinar la masa molar absoluta, el tamaño, la conformación, la conjugación y la agregación.
• Dispersión de luz dinámica convencional (basada en cubetas) y de alto rendimiento (basada en placas de micropocillos) para determinar el tamaño (radio), las distribuciones de tamaño, la temperatura de fusión de las proteínas y los parámetros indicativos de estabilidad.
• Cambio de movilidad electroforética (PALS) para determinar la carga molecular/potencial zeta
• Dispersión de luz de gradiente sintético para análisis sin etiquetas de interacciones biomoleculares
• Fraccionamiento de flujo de campo para separar macromoléculas y nanopartículas de 1 a 1000 nm, utilizado junto con dispersión de luz en línea y otras técnicas de detección para determinar la masa y el volumen molar.

White también ofrece, de forma limitada, servicios de análisis de muestras utilizando sus tecnologías únicas.